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La norme internationale ANSI/AAMI/ISO 111351, intitulée « Dispositifs médicaux – Validation et contrôle de routine de la stérilisation à l’oxyde d’éthylène, » décrit trois méthodes qui peuvent être utilisées pour la qualification de performance microbiologique :

  1. Méthode A, la méthode de la courbe de survie ;
  2. Méthode B, la méthode de la fraction négative ; et
  3. Méthode C, la méthode du demi-cycle. La Méthode C est traitée dans le Conseil technique 12 et ne sera pas présentée dans le présent document.

Le document 11135 fournit des instructions détaillées pour l’exécution de chaque méthode.

Les méthodes de test de laboratoire acceptables qui seront utilisées dans l’exécution des qualifications de performance microbiologique peuvent être consultées dans des références telles que la Pharmacopée des États-Unis.2 Toute méthode de test qui a été validée de façon adéquate par le laboratoire d’essai est acceptable pour les tests de performance microbiologique.

Méthode A : construction de la courbe de survie

La méthode de qualification de performance microbiologique par la construction de la courbe de survie consiste à exposer des dispositifs d’épreuve de procédé (DEP) inoculés à des temps d’exposition d’OE progressifs, extraire les indicateurs biologiques (IB) des DEP et énumérer ou compter le nombre d’organismes survivants sur chaque IB. Ces données génèrent un dénombrement de survivants qui peut ensuite être utilisé dans la réalisation d’une courbe de survie. La valeur D (le temps qu’il faut pour réduire la population de 90 pour cent ou de 1 log) peut alors être estimée à partir de la courbe de survie. Voici un exemple détaillé de la méthode de construction de la courbe de survie pour la qualification de performance microbiologique.

Préparer les DEP qui seront utilisés dans l’étude. Lors de la préparation des DEP, l’IB doit être placé dans l’emplacement le plus difficile à stériliser du DEP. Le choix de l’emplacement le plus difficile à stériliser du DEP doit être déterminé soit par un spécialiste de la stérilisation soit par la réalisation d’études de résistance. Au moins cinq DEP doivent être utilisés dans chaque étude de qualification. Le même nombre de DEP doit être utilisé dans chaque étude par la Méthode A.

Au moins cinq études doivent être menées aux temps d’exposition d’OE progressifs (par exemple, 0, 4, 8, 12, 16 minutes). Ces études peuvent nécessiter une réduction de la température, des concentrations réduites d’OE et/ou d’autres modifications de cycle pour réduire la létalité du cycle. Une fois que les paramètres du cycle sublétal sont sélectionnés, toutes les études fractionnelles doivent être effectuées en utilisant les mêmes paramètres de cycle, à l’exception du temps d’exposition d’OE. Au moins trois des temps d’exposition d’OE doivent aboutir à des IB dont les populations sont dénombrables.

La population de départ (N0) doit être utilisée pour servir de premier point (intercept Y) de la ligne de courbe de survie, suivie de quatre temps (progressifs) d’exposition d’OE. La population de départ doit être déterminée en utilisant les IB qui ont été exposés à toutes les étapes du procédé avant l’injection du stérilisant.

À la fin du cycle de stérilisation, retirer les DEP de la charge après que la contrainte de temps d’aération minimum ait été respectée. Certains pays fixent des contraintes de temps d’aération minimum qui doivent être satisfaites avant qu’un opérateur puisse prélever des échantillons ou travailler sur une charge ; une aération de 6 heures minimum est habituellement utilisée. Les DEP doivent être réfrigérés jusqu’à l’expédition et doivent être transmis au laboratoire d’essai dans une glacière avec un agent réfrigérant.

Le laboratoire d’essai devra ensuite effectuer un dénombrement de la population sur chaque IB après son extraction du DEP. Un dénombrement de la population peut être normalement effectué comme décrit ci-après :

  1. Transférer de manière aseptique chaque IB, extrait de l’enveloppe en papier cristal de protection (si elle persiste encore), dans un tube de dilution stérile distinct. Un tube de dilution est un tube de laboratoire, habituellement de 20 ml au total, qui a un bouchon à vis avec une garniture Teflon® (DuPont).
  2. Ajouter 4 à 6 billes de verre stériles et 10 ml d’eau stérile au tube de dilution. Il s’agit de votre tube de dilution de départ (10-1).
  3. Laisser l’IB se ramollir pendant 10 à 15 minutes ou jusqu’à 2 heures dans le réfrigérateur.
  4. À l’aide d’un vortex, faire macérer (séparer en petites fibres par des moyens mécaniques) les IB pendant environ 1 à 2 minutes. Les IB devront être macérés jusqu’à obtenir des fibres individuelles et jusqu’à ce qu’il ne reste plus aucun amas. L’utilisation d’un mélangeur pour la macération n’est pas recommandée en raison de l’énergie cinétique supplémentaire qu’il confère aux IB.
  5. Ajouter un supplément de 5 ml d’eau stérile dans le tube pour diluer les fibres des IB et pour éviter le colmatage lors des dilutions en série. Au moyen d’un vortex ou d’une agitation manuelle, bien mélanger le tube de dilution.
  6. Effectuer cinq dilutions en série en transférant via une pipette 1 ml du tube de dilution utilisé dans un nouveau tube de dilution contenant 9 ml d’eau stérile. Cela va générer les dilutions 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 et 10-6.
  7. Appliquer un choc thermique à toutes les dilutions qui seront testées. Le choc thermique est réalisé en plaçant les tubes de dilution dans un bain d’eau chaude qui a été équilibré à 80° C à 85° C (176° à 185° F). Les tubes doivent être laissés dans le bain d’eau chaude pendant 10 minutes de plus qu’il ne faut à un thermomètre placé dans un tube de dilution témoin contenant 10 ml de la même eau stérile utilisée dans le procédé de dilution pour chauffer jusqu’à 80° C.
  8. Retirer immédiatement les tubes de dilution du bain d’eau chaude et les placer dans un bain d’eau glacée.
  9. Créer des doubles de plaque d’écoulement pour chaque niveau de dilution. Une plaque d’écoulement est créée en transférant 1,5 ml de la dilution (bien mélangée) dans une boîte de Pétri, en versant de la gélose TSA dans la boîte de Pétri jusqu’à ce qu’elle forme une couche continue, en agitant la boîte de Pétri 15 à 20 fois pour disperser tous les organismes uniformément dans toute la plaque, puis en laissant la gélose durcir.
  10. Incuber la plaque d’écoulement retournée pendant 48 heures à 30° à 35° C (86° à 95° F).
  11. Compter toutes les colonies qui apparaissent et calculer la population d’organismes qui étaient présents sur les IB à chaque période d’exposition.

Une fois que la population de chaque IB est déterminée, une courbe de survie est construite en utilisant des techniques de corrélation pour tracer la régression linéaire des survivants par rapport au temps d’exposition d’OE. La pente de la droite de régression est ensuite utilisée pour estimer la valeur D de la population microbienne du DEP.

La valeur D multipliée par six (pour une réduction de 6 log) doit être l’intervalle minimum de temps d’exposition d’OE requis pour un demi-cycle réussi. Le temps d’exposition d’OE minimum requis pour un cycle complet réussi doit être la valeur D multipliée par douze (pour une réduction de 12 log). Dans la pratique réelle, si une étude de la valeur D est utilisée pour calculer le temps d’exposition d’OE du demi-cycle ou du cycle complet, cela rajoute un facteur de sécurité supplémentaire au temps d’exposition.

Méthode B : fraction négative

La méthode de qualification de performance microbiologique par la fraction négative consiste à exposer les dispositifs d’épreuve de procédé (DEP) inoculés à des temps d’exposition d’OE progressifs, extraire les indicateurs biologiques (IB) des DEP, plonger les IB dans les milieux de croissance, vérifier les milieux de croissance pour déceler tout signe de croissance et déclarer que les tests de stérilité des IB présentent une croissance/absence de croissance de l’IB. La proportion des IB sans croissance par rapport à ceux présentant une croissance et les intervalles de temps correspondants sont utilisés pour déterminer la valeur D. Voici un exemple détaillé de la méthode de la fraction négative pour la qualification de performance microbiologique.

Les DEP qui seront utilisés dans l’étude doivent être préparés de la même manière que ceux de la méthode de la courbe de survie. Au moins dix DEP doivent être utilisés dans chaque étude de qualification à chaque temps d’exposition. Le même nombre de DEP doit être utilisé dans chaque étude par la Méthode B. Au moins cinq études doivent être menées aux temps d’exposition d’OE progressifs (par exemple, 0, 4, 8, 12, 16, 20 minutes), si possible. Ces études peuvent nécessiter une réduction de la température, des concentrations réduites d’OE et/ou d’autres modifications de cycle pour réduire la létalité du cycle. Une fois que les paramètres du cycle sublétal sont sélectionnés, toutes les études fractionnelles doivent être effectuées en utilisant les mêmes paramètres de cycle, à l’exception du temps d’exposition d’OE.

Au moins une étude doit se traduire par une croissance de l’ensemble des IB des DEP. Au moins deux études doivent se traduire par une croissance fractionnelle des IB des DEP. Au moins deux études doivent conduire à l’inactivation totale ou l’absence de croissance de l’ensemble des IB des DEP. Des études supplémentaires peuvent être nécessaires si les résultats ci-dessus ne sont pas atteints.

À la fin du cycle de stérilisation, retirer les DEP de la charge après que la contrainte de temps d’aération minimum ait été respectée. Certains pays fixent des contraintes de temps d’aération minimum qui doivent être satisfaites avant qu’un opérateur puisse prélever des échantillons ou travailler sur une charge ; une aération de 6 heures minimum est habituellement utilisée. Les DEP doivent être réfrigérés jusqu’à l’expédition et doivent être transmis au laboratoire d’essai dans une glacière avec un agent réfrigérant.

Dès la réception, le laboratoire d’essai effectue alors un test de stérilité d’indicateur biologique sur chaque IB aussitôt qu’il est extrait du DEP. Un test de stérilité de l’indicateur biologique peut être effectué comme décrit ci-après :

  1. Transférer de manière aseptique chaque IB, extrait de l’enveloppe en papier cristal de protection (si elle persiste encore), dans un tube stérile contenant 30 ml de SCD/TSB (hydrolysat de caséine de soja/bouillon trypticase soja).
  2. Incuber les tubes pendant 7 jours à 30° à 35°C (86° à 95°F).
  3. Au bout de 7 jours, vérifier les tubes pour déceler tout signe de croissance.
  4. Consigner le nombre de croissances et d’absences de croissance pour chaque étude.

Si l’intervalle entre les temps d’exposition d’OE et le nombre de réplicats à chaque exposition est constant, l’équation de Spearman-Karber doit être utilisée pour calculer la valeur D. Si l’intervalle entre les temps d’exposition d’OE ou le nombre de réplicats à chaque exposition n’est pas constant, alors l’équation de Stumbo, Murphy, Cochran doit être utilisée pour calculer la valeur D. Les équations susmentionnées peuvent être consultées dans la norme ANSI/AAMI/ISO 11135 ou dans « Disinfection, Sterilization, and Preservation, »3 édité par Seymour S. Block.

La valeur D calculée multipliée par six (pour une réduction de 6 log) doit être l’intervalle minimum de temps d’exposition d’OE requis pour un demi-cycle réussi. Le temps d’exposition d’OE minimum requis pour un cycle complet réussi doit être la valeur D calculée multipliée par douze (pour une réduction de 12 log). Dans la pratique générale, si une étude de la valeur D est utilisée pour calculer le temps d’exposition d’OE du demi-cycle ou du cycle complet, cela rajoute normalement un facteur de sécurité supplémentaire au temps d’exposition.

Méthodes A et B : comparaison

La méthode de la fraction négative est la méthode préférée de qualification de performance microbiologique à la fois en raison de sa simplicité ainsi que de la complexité de la méthode de la courbe de survie. Lorsque les coûts sont un problème, la méthode de la fraction négative est dans ce cas aussi la méthode de choix, à moins qu’un laboratoire interne puisse être sollicité.

Références

  1. ANSI/AAMI/ISO 11135 – 2007, Dispositifs médicaux – Validation et contrôle de routine de la stérilisation à l’oxyde d’éthylène.
  2. La pharmacopée des États-Unis, USP 31ème édition, 2008.
  3. Anthony N. Parisi et William E. Young. Sterilization with Ethylene Oxide and Other Gases. As: Disinfection, Sterilization, and Preservation quatrième édition. Édité par Seymour S. Block. Lea et Febiger. Pages 580-595.

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